RT-PCR试剂盒
  一、样品RNA的制备
  1、用自选方法抽提病毒样品RNA。注意：可以选用本公司生产的一管式病毒RNAout
  2、或柱式病毒RNAout。
  二：RT（逆转录）反应合成cDNA
  .按下表配制RT反应体系（20μL体系）
  2.70℃保温5分钟变性模板后立即冰浴。
  3.严格按顺序加入6μLRTBuffer（含dNTP）和2μLMMLV逆转录酶（含RI），
  反应终体积为20μL。
  4.42℃保温60分钟。此步为RT反应。
  5.70℃保温0分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，丌需要纯化。
  反应五要素：
  参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
  引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
  ①引物长度：5-30bp，常用为20bp左右。
  ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至0kb的片段。
  ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
  ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
  ⑤引物3'端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
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