实验方案

1、外源基因的诱导表达：(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因.(2)按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌.(3)筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱,DNA序列测定,确定无误后进行下一步.(4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子,则在30-32℃培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至42℃继续培养3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等,则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L.继续培养3-5h.(5)取上述培养液1mL,1000g离心,1min,沉淀,加100μL聚丙烯Chemicalbook酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测.

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化：细菌的裂解常用方法有：①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶法;⑤化学渗透等.前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤.酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著.主要步骤为：4℃,5000rpm离心,15min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL).弃上清,约每克湿菌加3mL裂解缓冲液,悬浮沉淀.